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01940年10月19日，蒋介石指使何应钦、白崇禧致电朱德、彭德怀、叶挺，对坚持敌后抗战的八路军和新四军大肆污蔑，强令黄河以南的八路军、新四军1个月内撤到黄河以北。11月9日，中共中央以朱德、彭德怀、叶挺、项英名义发出致何应钦、白崇禧的“佳电”，驳斥“皓电”的造谣污蔑，拒绝要求八路军、新四军全部开到黄河以北的无理命令，同时表示为顾全国团结抗战大局，可以将皖南新四军移至长江以北。但12月8日，国民党顽固派又以何应钦、白崇禧名义发出“齐电”，坚持立场，进一步进行舆论宣传。
12月9日，蒋介石亲自发布让八路军、新四军限期北移的手令，并规定北移路线。同时，集结重兵，布防堵截，又秘密调集7个师约8万人的兵力，以求在长江南岸围歼新四军。12月下旬，蒋介石下达了将皖南新四军“一网打尽，生擒叶项”的反动命令。这样，震惊中外的皖南事变在国民党顽固派的阴谋策划下爆发了。
1941年1月4日，新四军军部及所属皖南部队9000余人，移师北上，6日行至泾县茂林地区，突然遭到预先埋伏的国民党7个师8万余人的包围袭击。在双方兵力悬殊的情况下，新四军将士奋勇拼杀，血战七昼夜，终因弹尽粮绝，除2000余人突围外，一部分被打散，大部分壮烈牺牲和被俘。军长叶挺在同国民党谈判时被扣押，政治部主任袁国平牺牲，副军长项英、副参谋长周子昆在突围中被叛徒杀害。17日，蒋介石发布反动命令和谈话，反诬新四军“叛变”，宣布取消新四军番号，声称将叶挺交给“军法审判”。这就是震惊中外的皖南事变。至此，国民党顽固派第二次高潮达到顶点。
皖南事变发生后，中共中央同国民党顽固派展开了针锋相对的斗争。1941年1月20日，毛泽东以中共中央军委发言人名义发表谈话，揭露国民党当局武装袭击新四军的暴行和阴谋。同月，中共中央军委发布重建新四军军部的命令，新军部于25日在苏北盐城成立，陈毅任代军长，刘少奇为政治委员，全军改编为7个师1个独立旅9万余人，继续坚持长江南北抗日战争。
在重庆，周恩来向国民党当局提出严重抗议，并在《新华日报》上奋笔疾书，写下了哀悼新四军将士的悼词：“为江南死国难者志哀！”“千古奇冤，江南一叶；同室操戈，相煎何急？！”这满含悲愤的悼词，产生了震撼人心的力量，深刻揭露了皖南事变的真相。在重庆的民主党派和爱国人士纷纷发表通电和文章，谴责国民党的暴行。国民党内部一些人士也不赞成蒋介石的投降分裂活动。国际上，苏联和美、英等国也谴责和反对蒋介石的分裂活动。蒋介石在政治上陷入困境。
面对各方的反对，国民党的活动不得不有所收敛。3月6日，蒋介石在国民参政会第二届会议上发表演说，“保证”决不再有“剿共”的军事行动。国民参政会选举董必武为驻会参政员，蒋介石约请周恩来面谈，答应解决国共之间的若干问题。至此，第二次高潮被击退。
这一次国共斗争，是国共两党力量的一次大检阅。经过这场暴风雨的洗礼，中国共产党在人们心目中的地位更高了，成为坚持团结抗战的中流砥柱。这次高潮被打退，充分显示了中国共产党在政治上的成熟，表明抗日民族统一战线内部的阶级力量对比已发生深刻的变动，对以后中国政治生活产生了深远的影响。
