第三章完结撒花！！ 本期复盘框架见下图：

本期节目对基因表达谱研究、基因突变、基因敲除进行了整理复盘，下一期节目会整理基因编辑、基因敲减、基因过表达与异位表达和基因蛋白相互作用的知识内容。

实验3：单酶切，水浴，酶切产物的回收与检测。 实验4：重组载体的构建（采用无缝克隆试剂盒），质粒转化与阴性对照 第一次做新的实验，每个步骤的细节都需要关注，可能老师没有关注到的，如果不及时问出来，可能就会导致实验时间延长。 昨天挺感慨的，之前做生物化学实验，是老师告诉我们每一步做什么，部分步骤也是老师做的，自己有参与度，但是不多，所以在基因工程的第一二次实验中，就发现自己并没有办法独立完成PCR和DNA回收检测的操作。 其实我挺喜欢自己独立操作的，但是有老师的帮助，真的会想偷懒。这次也是真的收获了很多。 另一点感慨呢，有的同学专业基础实验的操作步骤细节和原理没有完全理解，无法完全独立地操作，就着急卷入实验室参加课题组。唉，不理解，但总又能被焦虑到。好在能及时地开解自己，知道当前最重要的是什么。

这次实现了对以往的突破，在没有看课本和做的复盘笔记的情况下，凭借自己的记忆和逻辑录下了这次播客。其中有些许遗漏或者错误的地方，后面五分钟对照笔记本做了补充和修正。

十月上旬实在忙得团团转，落下的一些课程还没补上，复盘也落下了。没事，加把劲补起来。这次是赶在健身之前，用十五分钟左右时间录制的，有的地方吐词不太清晰。

国庆第一天假期，狠狠整理，原核表达载体节选，思维导图怒肝2h。才发觉做一次整理，录制播客，有多么需要时间和毅力。

绪论 三传一反和单元操作 第一章 流体流动 1.5节之前，前面5小节，主要是学习流体概念、分类、相关物理量、性质及其影响因素，同时还有流体静力学基本方程，流体流动时的物理量以及质量衡算（连续性方程）、机械能衡算（理想流体的伯努利方程和实际流体的）以及阻力损失的计算方法，另外还有流体形态的判断，不同形态的计算差异。

前面整理过了第二章的大部分内容，“其他工具酶”提到了T4 PNK和IIs型限制性核酸酶，还有其他几种重要的工具酶，例如：Gibson Assembly 同源重组无缝克隆技术、CRISPR-Cas技术、Dicer酶和重组酶等等。这次主要介绍剩下的这几种酶。

备注：戴耳机，边走路边录制的。口头叙述，可能有不详细或不连贯之处，建议自行查证。请见谅。 Shownotes： 00:00 引入：构建重组DNA分子的流程 一、限制性核酸内切酶 * 00:42 （一）发现与种类 * 01:20 （二）酶的命名 * 01:50 （三）II型限制性核酸内切酶的特征 * 02:55 （四）同裂酶和同尾酶 * 03:40 （五）酶切反应体系的组分 * 05:05 （六）影响酶切反应的因素 * 08:55 （七）酶切位点的引入与消失 二、DNA连接酶 * 11:50 （一）作用 * 12:20 （二）种类及作用 * 13:25 （三）不同酶切结果 * 15:20 （四）连接反应体系的组分 * 16:30 （五）影响连接反应的因素 三、DNA聚合酶 * 19:00 （一）大肠杆菌DNA聚合酶 * 21:30 （二）Klenow酶 * 22:15 （三）耐热的Taq酶 * 23:50 （四）T4 噬菌体DNA聚合酶 * 24:25 （五）逆（反）转录酶 四、碱性磷酸酶 * 27:20 （一）作用 * 28:05 （二）来源 * 28:25 （三）应用 五、末端脱氧核苷酸转移酶 * 32:00 （一）来源 * 32:25 （二）功能 * 33:10 （三）用途 六、其他工具酶 * 33:30 （一）T4多核苷酸激酶（T4-PNK） * 33:45 （二）IIs型限制性核酸酶 欢迎指出错误，交流讨论！

复盘思路： 1. 引言与复习目标 * 目标：对基因工程第一章序论部分进行总结与复盘。 * 关键词：基因工程的概念、克隆载体与表达载体的区别、基因工程诞生的前提、实验方案的设计。 2. 基因工程概念 * 定义：将外源目的基因和载体组合成重组DNA分子，导入受体细胞，使生物具有新特性。 * 狭义与广义： 狭义：外源基因转入宿主。 广义：包括外源基因转入和内源基因转出（如敲除和沉默）。 3. 基因工程诞生背景 * 理论前提： 遗传物质是DNA，而非RNA或蛋白质。 DNA的双螺旋结构和半保留复制机制。 遗传密码子的破译（简并性、摆动性、方向性）。 * 技术前提：三大发明。 * 诞生标志： 1972年：科学家体外获得猿猴病毒SV40和λDNA的重组DNA分子。 1973年：科学家获得具有抗生素抗性的大肠杆菌，基因工程诞生。 4. 基因工程基本操作流程 * 一般流程（五个步骤）： 目的基因分离与获取：已知序列：PCR或化学酶学合成。 未知序列：从文库中分离或逆转录获得cDNA。 重组DNA分子构建：将目的基因与载体（质粒、噬菌体等）连接。 重组DNA分子导入受体细胞：方法因受体细胞类型而异（如化学转化、显微注射等）。 外源基因阳性克隆的鉴定与筛选：酶切检测、PCR、核酸分子杂交或DNA测序。 外源基因表达。 * 克隆载体与表达载体的区别： 克隆载体：不能表达产物，仅用于DNA片段的复制与保存。 表达载体：可进行克隆和表达，具有启动子等表达调控元件。 5. 基因工程后续发展 * 重要事件： 1978年：发现人重组胰岛素。 1982年：转基因超级巨鼠。 1983年：第一个转基因植物烟草出现，PCR技术问世，人类基因组计划提出。 1990年：人类基因组计划启动。 1996年：克隆羊多利获得。 2006年：人类基因组计划完成，后基因时代开启。 2012年：CRISPR技术出现。 6. 基因工程的意义与应用 * 后基因时代：主要进行功能基因组学研究。 * 应用领域： 工业领域：环保（有机污染物降解）、能源（生物柴油、酒精）、食品（食品添加剂）。 农业领域：转基因农作物和动物（生物反应器）。 制药领域：抗生素、胰岛素等药物的生产。 7. 总结与提醒 * 关键词回顾：基因工程三大基本原件（外源目的基因、载体、受体细胞）、克隆载体与表达载体的区别、理论上和技术上的三大发现发明。 * 实验方案设计：注意流程和细节表述的清晰性。 口头叙述，可能有不详细或不连贯之处，建议自行查证。